2021年，經濟合作與發展組織（OECD）正式發布了（le）一項具有裏程碑意義的測試指（zhǐ）南——第497號（TG 497），首次將一套完（wán）整的綜合體外（wài）測試方案納入國（guó）際毒理學評價體係，該方案用於化學品（pǐn）的（de）皮膚致敏性評估，被視為可完全替代動物實（shí）驗。緊接（jiē）著，OECD於2022年又發布（bù）了另一項綜合體外測試方案TG 467，用於評估眼部腐蝕與刺激。盡（jìn）管目前僅有這兩項指南作為完全替代相應動物實驗的方案被納入官方毒理測試評價體（tǐ）係，但它們的推出仍標（biāo）誌著在部分（fèn）領域，非動物方法已由“輔助性工具”躍升為決策層麵（miàn）的主導手段，實現了特（tè）定毒（dú）理終點的完全替代。但正（zhèng）如TG 497的成功案例所揭示的那樣，實現“完全替（tì）代”的道路並非坦途——每一個被采納的替代方案都需要在對生物機製深入理解的基礎上，實現方法（fǎ）的標準化（huà）、完成多中心驗證及確保替代方案與人體真實（shí）反應的高度一致性。因此，目前替代成功更多是個別突破而非（fēi）普遍現（xiàn）象。在了解TG 497前（qián），先簡要了解下（xià）皮膚（fū）致敏的過程和機（jī）理：化（huà）合物引發皮膚致敏（mǐn）反應主要（yào）涉及（jí）三個連續的生物學（xué）過程。

首先，多數低分子質（zhì）量（通常小於（yú）500道爾頓）的化學物質本身不能被免疫係（xì）統直接識別，因此它們需首先與皮膚中的（de）蛋白質發生共價結合，形成所謂（wèi）的半抗原複合物。這種修飾（shì）後的（de）蛋白質結構被（bèi）免疫係統識別為“外來”，成為真正具有免疫原性的抗原，進而觸發（fā）遲發型（xíng）（IV型）變態反應，即皮膚致敏反應的起點（diǎn）；

第二步是角質形（xíng）成細胞的應激激活。在接觸化學物質（zhì）後，表皮中的角質形成細胞會被刺激而激活，釋放一係列促炎因子，如各種白細胞介素和胸腺基質淋巴細胞生（shēng）成素等。這些細胞因（yīn）子的釋（shì）放不僅增強局部（bù）炎症反應，還具有（yǒu）重要的免疫信（xìn）號功能，可（kě）吸引（yǐn）並激（jī）活樹突狀（zhuàng）細胞及朗格漢斯細胞向接（jiē）觸部位遷移；

第三步是樹突（tū）狀（zhuàng）細胞的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接觸（chù）刺激部位攝（shè）取半抗原複合物後，成熟並遷移至區域性淋（lín）巴結，在那裏與T細胞相互作用，完成抗原提呈，最終（zhōng）形成免疫記憶（yì）。該免疫記憶使（shǐ）得個體（tǐ）在後續暴露（lù）相同化學物質時迅速（sù）出現過敏反應，表現為典型的過敏性接觸性皮炎。

從皮膚首（shǒu）次（cì）接觸某種化學物（wù）質，到反複暴露後誘發過敏性接觸性皮炎（yán）的全過程，在現代毒理學中被統稱為“有害（hài）結局通（tōng）路”。該通路由多個生物（wù）學過程構成，其（qí）中的關鍵環（huán）節被稱為“關鍵事件”。由上文可知，皮膚致敏的有害結局通路包含三個關鍵事件，即（1）半（bàn）抗原形成；（2）角質（zhì）形成細胞的激活和（3）樹突（tū）狀細胞激活。在所有已知的“有害結局通路”中，皮膚致敏性（xìng）“有（yǒu）害結局通路”是建立最（zuì）早、機製最明確，且相對容易進行體（tǐ）外模擬的免疫反應，因此成為了替代方（fāng）法開發的突破（pò）口。

在傳統毒理學評估中，皮膚致敏性通常依賴動物整體反應模型進（jìn）行判斷，代表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致敏試驗，用於綜合（hé）評估致敏起始階段與激發階段的反應；（2）局部淋巴（bā）結試（shì）驗，聚（jù）焦於皮膚致敏階段。以局部淋（lín）巴結試驗為例，一次（cì）標準實驗需消耗至少20隻小（xiǎo）鼠。據統計，截至2018年，僅（jǐn）在歐盟REACH製度實施框架下就已有超過33,000隻小鼠被用於皮膚致敏性測試。

那麽TG 497中所列的動物替代技術是（shì）如何實現的（de）呢？TG 497 所采用的“三選二策（cè）略”是基於皮膚致敏性（xìng）有害結局通（tōng）路中的前三個關鍵事（shì）件所構建的一種綜合性評估方法，旨在判定受試化學物是否具有皮膚致敏潛力。

首先，直接肽反（fǎn）應實驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第一關鍵（jiàn）事件，即被測物是（shì）否具有與蛋白質共價結合形成（chéng）半抗原的能（néng）力（lì）。該方（fāng）法采（cǎi）用合成的含半胱氨酸（suān）或賴氨酸殘基的肽段作為模型受體，與被測物共同孵育後，通過測量肽的消耗率評估其反應性。反應結束（shù）後（hòu），利用高（gāo）效液相色譜對（duì）肽段殘留量進行定量分析。若肽的消耗顯（xiǎn）著（zhe），說明化學物能與肽（tài）發生共價反應，具備潛（qián）在致敏性，從而完成對半（bàn）抗原形（xíng）成（chéng）關鍵事件的評（píng）價。

其次，角（jiǎo）質形成細（xì）胞激活試驗（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用於評（píng）估第二（èr）關鍵（jiàn）事件——角質形成細胞的氧化應激與促炎反應激活，該事件在有害（hài）結局通路（lù）中處於信號放大的（de）早期階段。KeratinoSens™方法基於轉基因人永生化角質形成細胞係HaCaT，該細胞穩定表達（dá）一（yī）個由抗氧化反應元件驅動的熒光素酶報告（gào）基因。當潛在致敏物質刺激角質形成（chéng）細（xì）胞時，會引發細胞內應激響應，從而啟動熒光素（sù）酶表達。通（tōng）過測定熒光素酶活性，即（jí）可定量評估化學物對該（gāi）通路的激（jī）活能力，進而判斷其是否誘導（dǎo）角質形成細胞釋放（fàng）促炎因子。

最後，人源樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結局通路中的第三關鍵事件——樹突狀細胞的激活。在致敏過程中，被測物（wù）通過局部炎症信（xìn）號激活樹突狀細胞，後者在抗原識別、處理（lǐ）及向T細胞提呈抗原（yuán）的過程中起到橋梁作用。h-CLAT方法使用人急性單核細胞白（bái）血病細胞係THP-1作為樹突狀細胞的替代（dài）模型。當致敏（mǐn）化學物作（zuò）用於THP-1細胞後，若具免疫激活能力，將誘導其表（biǎo）麵（miàn）共（gòng）刺激分子（如CD86和CD54）表達上調（diào）。通過（guò）流式細胞分析檢測這些表麵標誌（zhì）物的相對熒光強度變化，即可判斷化學物是否具備激活免（miǎn）疫係統的潛（qián）能。

TG 497通過整合（hé）上述三種（zhǒng）機製互補的體外方法（fǎ），從生物學不同層麵綜合評估皮膚致敏性。隻要任（rèn）意兩項測試（shì）結果一致，即可做出科學、可靠的致敏性判斷（duàn），從而實現在此毒理（lǐ）終點上對動物實驗的完全替（tì）代。這三項（xiàng）方法各（gè）自針（zhēn）對皮膚致敏有害結局（jú）通路中的不同關鍵節點，組合使用時增強了判斷的穩健性和預測一致性。

TG 497被正式寫入OECD指南前，其開發團隊以（yǐ）及歐盟替代方法驗（yàn）證中心、美國替代方法驗證協調委員會和日本替代方法驗證中心都對其（qí）評估能力進行了驗證，並與傳統動物實驗方法如局部淋巴結試驗做了對比，結果顯示TG 497在多個（gè）核心指標（biāo）上全麵優於局部淋巴結試驗。具（jù）體表現為：在敏感性上，TG 497達到了87%，相比之下局部淋巴結試驗為72%，證明前者在識別真正致敏（mǐn）物方麵表（biǎo）現（xiàn）更（gèng）優；在特（tè）異性方麵，TG 497為88%，也明顯高於局部（bù）淋巴結試驗的75%，證明其在排除非致敏物時誤判（pàn）更少；在準確（què）率上，TG 497為87.5%，也高於局部淋巴結試驗的73%，證明其在整體預（yù）測效能上（shàng）表現更加平衡；更為關鍵（jiàn）的是，與人體不良反應數（shù）據（jù）的一（yī）致性上TG 497達到了“非常高”，而局部淋巴結試驗僅為“中等偏（piān）高”，這表（biǎo）明TG 497在臨床相關性上更具優勢。

綜上所述，TG 497不僅在科學性能上更為（wéi）出色，而且由於其（qí）不依賴動物實驗、與人體（tǐ）數據一致（zhì）性更高，因此得以成為目前首個被（bèi）國際監管（guǎn）機構OECD采納的完全替代皮膚致敏（mǐn）性動物試驗的標準體外測試方案。這一指南的頒布也標誌著毒理學替（tì）代方法（fǎ）從“輔助”邁入“決策級”應用的關鍵進展。

盡管TG 497的成功被視為替代（dài）毒理學領（lǐng）域的重要裏程（chéng）碑（bēi），但其背後反映出的研發過程也暴露了動物替代方法開發的諸多難點與局限。之所以能取得突破，首先因為（wéi）皮膚（fū）致敏反應是目（mù）前有害結局通路建立最完善的毒理路徑之一，機製簡單、事件（jiàn）明確（què）、模擬容易。相比之下，神經毒性、免疫毒性、內（nèi）分泌幹擾（rǎo）等終點路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現完全（quán）替代的體外組合方法。其次，TG 497研發成功的核心優勢還在於擁有有大量來自因斑貼測試、臨床案例和（hé）職業（yè）暴露的人體皮膚致敏不良反應數（shù）據可用於（yú）方（fāng）法（fǎ）驗（yàn）證。而多數（shù）其（qí）它毒理領域仍嚴重依賴於動物實驗數據，缺乏可比對的人體資料，從而限製了相應替代方案的（de）實際（jì）驗（yàn）證路徑。即便如此，TG 497成功進入OECD指南（nán）也曆經了漫（màn）長的驗證、標準化與互認過程。三項子方法（fǎ）最早（zǎo）提出可追溯至2006年前後，但直至2015年才以單獨（dú）測試方法形式被 OECD 采納，2021年方整合為 TG497——整個流程耗時逾10年。

此外TG 497在皮（pí）膚致敏（mǐn）評估中仍存在化學品適用範圍的盲區：它僅適用於小分子化學品，對金屬離子、複雜混合物（wù）、親水（shuǐ）性或高反應性物質尚不適用；同（tóng）時，也不適用於易幹擾測（cè）試（shì）係統穩定性的（de）強刺激性或腐蝕性化合物。

可以說，TG497 的誕（dàn）生既是一道分水嶺，也是一麵鏡子：一方麵，它首（shǒu）次證明“綜合測試方案”完全可以獲得監管（guǎn）層麵的認可，為 OECD 體係內其（qí）他毒理終點開發類似方法樹立（lì）了範式；另一方麵，它警示（shì）我們，唯有深入掌握生物（wù）機製、係統整合多源數據（jù）並（bìng）實（shí）現方法標準化與多中心驗證，替代策略方能真正落（luò）地。更進一步，TG497 的成功表明，替代路徑（jìng）更適用於（yú）機製清晰、易於體（tǐ）外模擬且人體數（shù）據（jù）相對充足（zú）的毒理終點。總之，替代（dài）並非簡化（huà），不是單憑熱情就可以“一蹴而就”的，而是在更高（gāo）科學規範（fàn）要求（qiú）下，通過持續演（yǎn）化（huà）與完善才能夠得以實現；同時，其研發仍離（lí）不（bú）開動物實驗與人（rén）體反應數（shù）據的（de）對照與支撐。因此，盡（jìn）管TG497 為全（quán）麵替（tì）代動物實驗開了一個好頭，但在所有領域都實現這一目標仍有漫長的科學探索與製度建設之路要走。